Filtr fluorescencyjny jest niezbędnym elementem mikroskopu fluorescencyjnego. Typowy system składa się z trzech podstawowych filtrów: filtra wzbudzenia, filtra emisji i zwierciadła dichroicznego. Są one zwykle pakowane w sześcian, tak że grupę można włożyć razem do mikroskopu.
Jak działa filtr fluorescencyjny?
Filtr wzbudzenia
Filtry wzbudzenia przepuszczają światło o określonej długości fali i blokują inne długości fal. Można ich używać do tworzenia różnych kolorów, dostosowując filtr tak, aby przepuszczał tylko jeden kolor. Filtry wzbudzenia występują w dwóch głównych typach — filtry długoprzepustowe i filtry pasmowoprzepustowe. Wzbudnikiem jest zwykle filtr pasmowo-przepustowy, który przepuszcza tylko długości fal pochłaniane przez fluorofor, minimalizując w ten sposób wzbudzanie innych źródeł fluorescencji i blokując światło wzbudzenia w paśmie emisji fluorescencji. Jak pokazuje niebieska linia na rysunku, BP wynosi 460-495, co oznacza, że może przejść jedynie przez fluorescencję 460-495nm.
Umieszczony jest na ścieżce oświetlenia mikroskopu fluorescencyjnego i odfiltrowuje wszystkie długości fal źródła światła z wyjątkiem zakresu wzbudzenia fluoroforu. Minimalna transmisja filtra decyduje o jasności i blasku obrazów. Zalecane jest minimum 40% transmisji dla każdego filtra wzbudzenia, tak aby w idealnym przypadku transmisja wynosiła > 85%. Szerokość pasma filtra wzbudzającego powinna mieścić się całkowicie w zakresie wzbudzenia fluoroforu, tak aby środkowa długość fali (CWL) filtra była jak najbliżej szczytowej długości fali wzbudzenia fluoroforu. Gęstość optyczna filtra wzbudzenia (OD) decyduje o ciemności obrazu tła; OD jest miarą tego, jak dobrze filtr blokuje długości fal spoza zakresu transmisji lub szerokości pasma. Zalecana jest minimalna wartość OD wynosząca 3,0, ale optymalna jest wartość OD wynosząca 6,0 lub większa.
Filtr emisji
Celem filtrów emisyjnych jest umożliwienie dotarcia pożądanej fluorescencji z próbki do detektora. Blokują krótsze fale i mają wysoką transmisję w przypadku dłuższych fal. Z typem filtra powiązana jest także liczba, np. na rysunku BA510IF (filtr z barierą przeciwzakłóceniową), oznaczenie to odnosi się do długości fali przy 50% jej maksymalnej transmisji.
Te same zalecenia dotyczące filtrów wzbudzenia odnoszą się do filtrów emisji: minimalna transmisja, szerokość pasma, OD i CWL. Filtr emisji z idealną kombinacją CWL, minimalnej transmisji i OD zapewnia najjaśniejsze możliwe obrazy z najgłębszym możliwym blokowaniem i zapewnia wykrycie najsłabszych sygnałów emisji.
Lustro dichroiczne
Zwierciadło dichroiczne jest umieszczone pomiędzy filtrem wzbudzenia a filtrem emisji pod kątem 45° i odbija sygnał wzbudzenia w kierunku fluoroforu, jednocześnie przesyłając sygnał emisji w stronę detektora. Idealne filtry dichroiczne i rozdzielacze wiązki charakteryzują się ostrymi przejściami pomiędzy maksymalnym odbiciem a maksymalną transmisją, z odbiciem > 95% dla szerokości pasma filtra wzbudzenia i transmisją > 90% dla szerokości pasma filtra emisji. Wybierz filtr, mając na uwadze długość fali przecięcia (λ) fluoroforu, aby zminimalizować światło rozproszone i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu obrazu fluorescencyjnego.
Zwierciadło dichroiczne na tym rysunku to DM505, nazwane tak, ponieważ 505 nanometrów to długość fali przy 50% maksymalnej transmisji dla tego zwierciadła. Krzywa transmisji dla tego zwierciadła pokazuje wysoką transmisję powyżej 505 nm, gwałtowny spadek transmisji na lewo od 505 nanometrów i maksymalny współczynnik odbicia na lewo od 505 nanometrów, ale nadal może występować pewna transmisja poniżej 505 nm.
Jaka jest różnica między filtrami długoprzepustowymi i pasmowymi?
Filtry fluorescencyjne można podzielić na dwa typy: długoprzepustowy (LP) i środkowoprzepustowy (BP).
Filtry długoprzepustowe przepuszczają długie fale i blokują krótsze. Długość fali odcięcia to wartość przy 50% transmisji szczytowej, a wszystkie długości fali powyżej tej wartości są transmitowane przez filtry długoprzepustowe. Są one często stosowane w zwierciadłach dichroicznych i filtrach emisyjnych. Filtrów długoprzepustowych należy używać, gdy aplikacja wymaga zbierania maksymalnej emisji i gdy dyskryminacja widmowa nie jest pożądana lub konieczna, co zazwyczaj ma miejsce w przypadku sond generujących pojedynczą substancję emitującą w próbkach o stosunkowo niskim poziomie autofluorescencji tła.
Filtry pasmowo-przepustowe transmitują tylko określone pasmo długości fali, a blokują inne. Redukują przesłuchy, umożliwiając transmisję tylko najsilniejszej części widma emisji fluoroforów, redukują szum autofluorescencji, a tym samym poprawiają stosunek sygnału do szumu w próbkach autofluorescencji o wysokim tle, czego nie są w stanie zapewnić filtry długoprzepustowe.
Ile rodzajów zestawów filtrów fluorescencyjnych może dostarczyć BestScope?
Niektóre popularne typy filtrów obejmują filtry niebieski, zielony i ultrafioletowy. Jak pokazano w tabeli.
| Zestaw filtrów | Filtr wzbudzenia | Lustro dichroiczne | Filtr barierowy | Długość fali lampy LED | Aplikacja |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Metoda z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych ·Oranż kwasowy: DNA, RNA ·Auramina: Bacillus gruźlicy ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rhodamine, TRITC: Metoda z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych ·Jodek propidyny: DNA ·Zapytanie ofertowe |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Obserwacja autofluorescencji ·DAPI: barwienie DNA ·Hoechest 332528, 33342: stosowany do barwienia chromosomów |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Katecholaminy ·5-hydroksytryptamina ·Tetracyklina: Szkielet, Zęby |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Zestawy filtrów używane w akwizycji fluorescencyjnej są zaprojektowane w oparciu o główne długości fal używane w zastosowaniach fluorescencyjnych, które opierają się na najczęściej używanych fluoroforach. Z tego powodu nazywane są również od fluoroforów, do których są przeznaczone do obrazowania, takich jak kostki filtracyjne DAPI (niebieskie), FITC (zielone) lub TRITC (czerwone).
| Zestaw filtrów | Filtr wzbudzenia | Lustro dichroiczne | Filtr barierowy | Długość fali lampy LED |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramina | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Teksas czerwony | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Jak wybrać filtr fluorescencyjny?
1. Zasada doboru filtra fluorescencyjnego polega na tym, aby światło fluorescencyjne/emisyjne przechodziło jak najdalej przez końcówkę obrazującą i jednocześnie całkowicie blokowało światło wzbudzające, tak aby uzyskać najwyższy stosunek sygnału do szumu. Zwłaszcza w przypadku zastosowania mikroskopu ze wzbudzeniem wielofotonowym i całkowitym odbiciem wewnętrznym, słaby szum będzie również powodować duże zakłócenia w efekcie obrazowania, dlatego wymagania dotyczące stosunku sygnału do szumu są wyższe.
2. Znać widmo wzbudzenia i emisji fluoroforu. Aby skonstruować zestaw filtrów fluorescencyjnych, który generuje wysokiej jakości obraz o wysokim kontraście z czarnym tłem, filtry wzbudzenia i emisji powinny osiągnąć wysoką transmisję przy minimalnym tętnieniu pasma przepustowego w obszarach odpowiadających pikom lub emisjom wzbudzenia fluoroforu.
3. Weź pod uwagę trwałość filtrów fluorescencyjnych. Filtry te muszą być odporne na intensywne źródła światła generujące światło ultrafioletowe (UV), które może prowadzić do „przepalenia”, zwłaszcza filtra wzbudnicy, ponieważ jest on poddawany działaniu pełnego natężenia źródła oświetlenia.
Różne przykładowe obrazy fluorescencyjne
Zasoby są gromadzone i organizowane w Internecie i służą wyłącznie do nauki i komunikacji. W przypadku jakichkolwiek naruszeń prosimy o kontakt w celu usunięcia.
Czas publikacji: 09 grudnia 2022 r