Mikroskop fluorescencyjny to rodzaj mikroskopu optycznego, który wykorzystuje źródło światła o dużej intensywności do oświetlenia próbki i wzbudzenia fluorochromów w próbce. Oświetlenie próbki zwykle odbywa się za pomocą źródła światła emitującego światło ultrafioletowe. Są szeroko stosowane w biologii, medycynie i przemyśle.
Jak działa mikroskop fluorescencyjny?
Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje lampę rtęciową lub ksenonową do wytwarzania światła ultrafioletowego. Światło dociera do mikroskopu i uderza w lustro dichroiczne – lustro, które odbija jeden zakres długości fal i przepuszcza inny zakres. Lustro dichroiczne odbija światło ultrafioletowe aż do próbki. Niektóre okazy fluoryzują naturalnie w świetle ultrafioletowym, ponieważ zawierają substancje fluorescencyjne, takie jak chlorofil. Jeżeli oglądany okaz nie wykazuje naturalnej fluorescencji, można go zabarwić barwnikami fluorescencyjnymi zwanymi fluorochromami.
Z czego składa się mikroskop fluorescencyjny?
1. Źródło światła
Najpopularniejszymi źródłami światła są rtęć, ksenon i diody LED. Rtęć zapewnia najlepszą jakość światła dla mikroskopu fluorescencyjnego. Diody LED stają się coraz bardziej popularne, ponieważ są tańsze niż inne źródła i zużywają mniej energii.
| Lampa rtęciowa | Lampa ksenonowa | PROWADZONY | |
| Długość fali emitowanego światła | 350-370 nm | 400 nm ~ 450 nm | 400-700 nm |
| Czas życia (godzina) | 200-300 | 400-600 | 10000 |
| Korzyść | 1. Światło o dużej intensywności, najczęstsze źródła światła. 2. Emituje silne ultrafiolet i niebiesko-fioletowy, aby wzbudzić wszelkiego rodzaju fluorofory. 3. Jasne i kolorowe obrazy. | 1. Intensywność widmowa jest stabilna. 2. Silna intensywność widmowa w podczerwieni i średniej podczerwieni. | 1. Łatwa wymiana. 2. Nie ma potrzeby się rozgrzewać. 3. Można natychmiast włączać i wyłączać. 4. Kontroluj intensywność źródła światła. |
| Niekorzyść | 1. Krótkie życie. 2. Długi czas nagrzewania. | 1. W przypadku nadmiaru ciepła wymagany jest specjalny zasilacz prądu stałego niskiego napięcia. 2. Droższe niż lampa rtęciowa | 1. Światło UV jest słabsze niż lampa rtęciowa. 2. Każda długość fali światła wymaga osobnej diody LED ze względu na wąskie pasmo, jakie emitują. |
Nasadka fluorescencyjna rtęciowa
Przystawka fluorescencyjna LED
2. Filtr wzbudzenia
Filtr wzbudzenia jest niezbędny do działania mikroskopu fluorescencyjnego. Przepuszcza światło o krótszej długości fali, które barwnik fluorescencyjny mógłby pochłonąć. Blokuje także inne źródła ekscytującego światła.
Filtr wzbudzenia (B, G, U, V)
3. Lustro dichroiczne
Lustro dichroiczne to rodzaj filtra optycznego, który odbija światło o określonych długościach fal, przepuszczając inne. Stosowany jest w mikroskopach fluorescencyjnych do oddzielania długości fali wzbudzenia i emisji.
4. Filtr emisji
Filtr emisji przepuszcza tylko długości fal emitowane przez fluorofor i blokuje całe niepożądane światło spoza tego pasma – zwłaszcza długości fal wzbudzenia.
5. Barwniki fluorescencyjne
Barwniki fluorescencyjne to związki organiczne posiadające właściwość fluorescencji, dzięki której mogą tworzyć obraz fluorescencyjny, emitując widzialne zielone światło o dużym kontraście po wzbudzeniu przez silnie oświetlające światło ultrafioletowe. Powszechnie stosowanymi barwnikami fluorescencyjnymi są; DAPI (49,6-diamidyno-2-fenyloindol), oranż akrydynowy, auramina-rodamina, Alexa Fluors lub DyLight 488.
Ile rodzajów mikroskopów fluorescencyjnych?
1. Stojący mikroskop epifluorescencyjny:
Jest to najpopularniejszy typ mikroskopu fluorescencyjnego. Wzbudzenie fluoroforu i detekcja fluorescencji odbywa się na tej samej drodze światła (tj. przez obiektyw). Większość mikroskopów fluorescencyjnych, szczególnie tych stosowanych w naukach przyrodniczych, ma konstrukcję epifluorescencyjną.
Biologiczny mikroskop fluorescencyjny BS-2081F
2. Konfokalny mikroskop fluorescencyjny:
Konfokalny mikroskop fluorescencyjny: Ten typ mikroskopu fluorescencyjnego łączy skanowanie laserowe z oświetleniem fluorescencyjnym w celu wytworzenia obrazu. Można go stosować w szerokim zakresie zastosowań, takich jak badanie komórek i tkanek, wykrywanie białek i innych substancji w komórkach oraz pomiar grubości materiałów.
Biologiczny mikroskop fluorescencyjny BS-2081F
3. Odwrócony mikroskop fluorescencyjny
Źródło światła i kondensor tego rodzaju mikroskopu znajdują się na górze, skierowane w dół. Kąt oświetlenia musi wynosić 90 stopni w stosunku do powierzchni badanej próbki.
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny BS-2095F
Jakie są zalety i wady mikroskopów fluorescencyjnych?
Zalety:
- Umożliwia obserwację komórek organizmów żywych bez ich uszkadzania
- Zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości i dokładnych kolorach
- Umożliwia badanie procesów zachodzących w komórkach
- Służy do identyfikacji różnych typów cząsteczek wewnątrz komórek, takich jak białka lub kwasy nukleinowe.
Wady:
-Pozwala jedynie na obserwację określonych struktur wewnątrz komórki oznaczonej barwnikiem fluorescencyjnym.
- Fotowybielanie spowodowane wzbudzeniem elektronów podczas procesu fluorescencji może wpływać na reaktywne cząsteczki barwników fluorescencyjnych. W rezultacie barwniki reaktywne mogą utracić swoje właściwości chemiczne związane z intensywnością emisji fluorescencji.
-Komórki są podatne na efekt fototoksyczny po zabarwieniu barwnikami fluorescencyjnymi, ponieważ cząsteczki fluoroforu absorbują fotony o wysokiej energii ze światła o krótkiej długości fali.
Jakie są zastosowania mikroskopu fluorescencyjnego?
Mikroskopy fluorescencyjne są szeroko stosowane w różnych dziedzinach badań i zastosowań, w tym w biochemii, biologii komórki, mikrobiologii, immunologii i medycynie.
1. W biologii mikroskop fluorescencyjny umożliwia dokładną i szczegółową identyfikację komórkowych i submikroskopowych składników i aktywności komórkowych za pomocą znakowania barwnikiem fluorescencyjnym.
2. W medycynie mikroskop fluorescencyjny może wykorzystywać odczynniki fluorescencyjne do wykrywania obecności i rozmieszczenia bakterii i wirusów lub do wspomagania znakowania celów chirurgicznych w celu ułatwienia operacji.
3. W dziedzinie mineralogii mikroskop fluorescencyjny jest często używany do badania substancji o właściwościach spontanicznej fluorescencji, takich jak asfalt, ropa naftowa, węgiel, tlenek grafenu i inne minerały.
4. W materiałoznawstwie mikroskop fluorescencyjny może być stosowany w przemyśle tekstylnym lub papierniczym do analizy materiałów na bazie włókien.
Czas publikacji: 14 marca 2023 r